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GROUP MEMBERS

Dra. YOLANDA SÁNCHEZ MARTÍN. Profesora Titular.

PATRICIA GARCÍA RODRÍGUEZ. Becaria predoctoral (JCyL).
SANDRA MARGARITA CRUZ QUINTANA. Becaria predoctoral (BSCH/USAL).
SOFIA MUÑOZ FELIZ. Becaria de colaboración.
JUDITH ALONSO NIETO. Becaria de colaboración



Cell Wall and Morphogenesis in Yeast Group 03 - 08

El crecimiento polarizado y la biosíntesis de la pared celular en Schizosaccharomyces pombe

Las células eucariotas establecen y mantienen una forma particular en respuesta estímulos tanto intracelulares como extracelulares. Como mantienen y regulan su forma y tamaño las células eucariotas son preguntas claves en biología molecular. Schizosaccharomyces pombe es un microorganismo ideal para la realización de estudios de polaridad, ya que su forma, tamaño y su ciclo de división celular son extremadamente reproducibles en el laboratorio, además se pueden obtener mutantes con morfologías aberrantes sin pérdida de la viabilidad.

En nuestro grupo tratamos de identificar y caracterizar proteínas de señalización que participen en la construcción del citoesqueleto, la secreción polarizada y la biosíntesis de la pared celular en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe. En particular estudiamos la señalización por la GTPasa Rho1p, que juega un papel esencial en la remodelación del citoesqueleto y que se regula como un interruptor molecular ON/OF, cambiando de un estado activo (unida a GTP) a un estado inactivo (unida a GDP). Una de nuestras aportaciones ha sido caracterizar los GEFs de Rho1p que son las proteínas encargadas catalizar el intercambio de GDP por GTP y demostrar que cada uno de ellos es responsable de la activación de la GTPasa en un momento determinado del ciclo celular y/o en un lugar de la célula, especificando sus funciones.
Regulación de las GTPasas. Los GEFs son reguladores positivos, catalizan el intercambio de GDP por GTP in vivo, activando a la GTPasa. En este estado activo (unido a GTP) las proteínas Rho transducen la señal interaccionando con sus efectores. Los GAPs son reguladores negativos que aumentan la actividad GTPasica de las proteínas Rho.
Rgf1p, Rgf2p y Rgf3p son GEFs de Rho1p en S. pombe

Usamos una combinación de métodos de biología molecular y genética para aumentar o eliminar la expresión de determinadas proteínas de señalización y estudiar su papel en el control de la polaridad y de la integridad celular. Las células de los mutantes obtenidos son analizadas mediante microscopia confocal y de time–lapse para estudiar su morfología y la localización de determinadas proteínas. Estas aproximaciones se complementan con técnicas bioquímicas que nos sirven para establecer interacciones proteína-proteína y cambios en la fosforilación, y nos ayudan a entender como actúan las proteínas de señalización en las transiciones de crecimiento polarizado y frente a determinados tipos de estrés.  Aproximadamente 1% del genoma humano codifica proteínas que regulan o son  reguladas por miembros de la familia Rho de GTPasas. El estudio de los reguladores de Rho1p en S. pombe nos permitirá entender mejor los mecanismos de regulación de procesos celulares esenciales como la división celular y su conexión con el mantenimiento de la integridad celular y la morfogénesis.

Rgf1p (marcada con GFP) se localiza en uno o en ambos polos en células en interfase y en el septo de división durante la citokinesis. En un mutante que carece del gen rgf1+, las células crecen de forma monopolar mientras que en la cepa silvestre crecen por ambos polos (marcados con una flecha). La fluorescencia azul se debe al Calcofluor que se une a los polímeros de la pared celular.

 

RESEARCH INTERESTS

1.- Estudio del mecanismo de activación del crecimiento bipolar en Schizosaccharomyces pombe.

 Las células de S. pombe crecen apicalmente, al principio del ciclo celular (recién divididas), las células activan el crecimiento únicamente por el polo heredado de la célula madre (polo antiguo). En un punto del ciclo celular, al inicio de la fase G2, se activa el crecimiento del polo originado como consecuencia de la división celular anterior (polo nuevo), en el proceso denominado NETO (New End Take Off), y, como consecuencia de ello, las células adquieren un patrón de crecimiento bipolar.

En nuestro laboratorio hemos clonado y caracterizado tres proteínas con dominio Rho-GEF, Rgf1p, Rgf2p y Rgf3p (Rho gef), todas son activadoras de Rho1p (componente regulador de la actividad 1,3-b-glucan sintasa) en S. pombe. Rgf1p regula a Rho1p durante el la transición de crecimiento polarizado conocida como NETO y activa el complejo b-GS. Las células rgf1D se lisan por uno de los polos y presentan un defecto en la reorganización de la actina necesaria para la transición del crecimiento monopolar a crecimiento bipolar. Recientemente, hemos visto que Rgf1p es necesario para la fosforilación de la MAPK Pmk1p en respuesta a estrés osmótico y a estrés producido por daños en la pared, indicando que podría tener un papel importante en la remodelación de la pared también en situaciones de estrés. Rgf1p podría coordinar la deposición de actina con la biosíntesis de la pared celular durante NETO, permitiendo a las células remodelar su pared sin riesgo de ruptura.

  • Estudiar la función de Rgf1p en la regulación del citoesqueleto de actina durante la transición de crecimiento bipolar (NETO).
  • Definir la relación de Rgf1p con el complejo denominado “polarisoma”.

2.- Estudio del mecanismo de separación celular en Schizosaccharomyces pombe.

En S. pombe la citocinesis se produce mediante la formación de un anillo de actomiosina, seguido por la deposición de un septo de división que debe ser degradado para que se liberen las dos células hijas. Cuando el anillo está correctamente organizado, comienza la contracción orquestada por un grupo de proteínas reguladoras que forman la ruta de activación de la septación o ruta SIN (Septation Initiation Network). Nosotros hemos descrito que Rgf3p es esencial para el mantenimiento de la integridad celular y actúa activando la síntesis de b–glucano específicamente durante la separación celular. También sabemos que la localización de Rgf3p en la zona media depende de los componentes del anillo de actomiosina Cdc15p y Cdc12p y de la activación de la ruta SIN.

Puesto que no se conocen los efectores de la ruta SIN, nos preguntamos si Rgf3p, un activador de Rho1p (la subunidad reguladora de la b(1,3)-GS) esencial en citocinesis, podría ser regulado por la ruta SIN en el proceso de formación del septo. Tenemos varios datos genéticos y bioquímicos que apuntan en este sentido. En estos momentos nuestros trabajos se centran en el estudio de la regulación espacial y temporal de Rgf3p. 

  • Estudio del mecanismo de contracción en la citocinesis y de la regulación de Rgf3p por la polo kinasa y por la ruta de activación de la septación.
  • Estudio de la relación de Rgf3p con proteínas que participan en la formación y en la disolución del septo, glucan sintasas y glucanasas respectivamente.

3.- Caracterización de sensores y nuevas moléculas que participen en la respuesta a daños en la pared.

Los sensores descritos en levaduras son proteínas transmembranales que poseen un pequeño dominio citoplasmatico en el extremo carboxilo terminal, un único dominio transmembranal y un ectodominio periplasmico rico en serinas y treoninas. Las regiones extracelulares están altamente O-manosiladas y podrían funcionar como antenas o detectores del estado de la pared celular, aunque esto no ha sido demostrado. Nuestro objetivo consistirá en caracterizar sensores de superficie y otras moléculas implicadas en detectar y transmitir el estado de la pared celular a Rho1p a través de las proteínas GEF, Rgf1p, Rgf2p y Rgf3p o por otros mecanismos.

  • Estudio del papel de los posibles sensores en la regulación del crecimiento y en la biosíntesis de la pared celular en S. pombe.
  • Estudio de la interacción de los sensores con los reguladores de Rho1p, Rgf1p, Rgf2p y Rgf3p

 PROJECTS
Los reguladores de la GTPasa Rho1 y el control de la polaridad, la integridad y la citocinesis en Schizosaccharomyces pombe. CICYT, BFU2008-00963/BMC. 2009-2011. Dra. Y. Sánchez.

Morfogénesis en levaduras: Biogénesis de la pared celular fúngica, su relación con el crecimiento celular y su utilización como diana en la busqueda de nuevos agentes antifúngicos. GR231. 2008-2010. Dr. A. Durán.

Caracterización de reguladores de la biosíntesis de la pared celular durante la división celular en Schizosaccharomyces pombe. SA008A/07. 2007-2008. Dra. Y. Sánchez.

Caracterización de nuevos reguladores de GTPasas en Schizosaccharomyces pombe y su participación en morfogénesis. BFU-2005-01557. 2006-2008. Dra. Y. Sánchez.

Biogénesis de la pared celular fúngica: Biosíntesis y remodelación de una estructura morfogenésica modelo que es, además, una diana para la búsqueda de nuevos agentes antifúngicos. Proyecto de Investigación para grupos de excelencia de la Junta de Castilla y León. CSI02C05. 2005-2006. Dr. Angel Durán Bravo.

Estudio de las subunidades catalíticas a y b-glucán sintasas de Schizosaccharomyces pombe. Dianas útiles para el diseño de nuevos antifúngicos. CICYT, BIO2001-1663. 2001-2004. Dra. Y. Sánchez.



REPRESENTATIVE PUBLICATIONS

GARCIA, P., GARCIA, I., MARCOS, F., RUIZ DE GARIBAY, G., SANCHEZ, Y. 2009. Fission yeast Rgf2p is a Rho1p guanine nucleotide exchange factor required for spore wall maturation and for the maintenance of cell integrity in the absence of Rgf1p. Genetics, Accepted

GARCIA, P., TAJADURA, V., SANCHEZ, Y. 2009. The Rho1p exchange factor Rgf1p signals upstream from the Pmk1 mitogen-activated protein kinase pathway in fission yeast. Mol Biol Cell. 20: 721-731 Pubmed

GARCÍA, P., TAJADURA, V., GARCÍA, I., SÁNCHEZ, Y. 2006. Role of Rho GTPases and Rho-GEFs in the regulation of cell shape and integrity in fission yeast. Yeast 23: 1031-1043. Pubmed

GARCIA P, TAJADURA V, GARCIA I, SANCHEZ Y. 2006. Rgf1p is a specific Rho1-GEF that coordinates cell polarization with cell wall biogenesis in fission yeast. Mol. Biol. Cell  17: 1620-1631. Pubmed

GARCIA, I., TAJADURA, V., MARTIN, V., TAKASHI, T., SANCHEZ, Y. 2006.Synthesis of a–glucans in fission yeast spores is carried out by three alpha-glucan synthase paralogs, Mok12p, Mok13p and Mok14p. Mol. Microbiol. 59:836-853. Pubmed

 GARCIA, I., JIMENEZ, D., MARTIN, V., DURAN, A. SANCHEZ, Y. 2005. Agn1p, a putative a-(1,3)glucanase, is required for cell separation in Schizosaccharomyces pombe. Biol. Cell 97:569-576. Pubmed

 CORTES, J. C. G., CARNERO, E., ISHIGURO, J., SANCHEZ, Y., DURAN, A., RIBAS J. C. 2005. The novel (1,3)Beta-D-glucan synthase catalytic subunit bgs4p from fission yeast is essential during both cytokinesis and polarized growth. J. Cell Sci. 118:157-174. Pubmed

TAJADURA, V., GARCIA, B., GARCIA, I., GARCIA, P., SANCHEZ, Y. 2004.  Schizosaccharomyces pombe Rgf3p is a specific Rho1-GEF that regulates cell wall Beta-glucan biosynthesis through the GTPase Rho1p. J. Cell Sci. 117: 6163-6174. Pubmed

 MARTIN, V., GARCIA, B., CARNERO, E., DURAN, A., SANCHEZ, Y. 2003.  Bgs3p, a putative 1,3-ß-glucan synthase subunit, is required for cell wall assembly in Schizosaccharomyces pombe.  Eukaryot. Cell 2: 159-169.


OPPORTUNITIES

If you are interested in any of our work and would like to join the group as a graduate student or postdoctoral fellow, then please write to Dra. YOLANDA SÁNCHEZ ( ysm@usal.es ) and include a copy of your current C.V.